生物信息的传递：从RNA到蛋白质

分子生物学
第四章知识点总结

\chapter{生物信息的传递：从RNA到蛋白质}


\begin{itemize}
    \item \redbf{转录是基因表达的第一步，翻译是基因表达的第二步。}
    \item \redbf{翻译}:以mRNA为模板，按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则(三联体密码)合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质。包括翻译的起始肽链的延伸、肽链的终止与释放。
    \item \redbf{核糖体(rRNA+蛋白)是蛋白质合成的场所}，mRNA是蛋白质合成的模板，转运RNA(tRNA)是模板与氨基酸之间的接合体。
\end{itemize}
翻译需要多种因子的参与。

在真核细胞中，有70种核糖体蛋白质，20种以上的氨酰-tRNA合成酶(AA-tRNAsynthetase)，10多种起始因子、延伸因子及终止因子，50种左右tRNA及各种rRNA、mRNA和100种以上翻译后加工酶参与蛋白质合成和加工过程。

蛋白质是基因表达的最终产物，是组成细胞的主要成分。蛋白质的生物合成过程，主要包括:
\begin{itemize}
    \item \redbf{翻译的起始} 核糖体与mRNA结合并与氨酰-AtRNA生成起始复合物。
    \item \redbf{肽链的延伸} 核糖体沿mRNA5'端向3端移动，开始从N端向C端的多肽合成。
    \item \redbf{肽链的终止及释放} 核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。
\end{itemize}
\section{遗传密码三联子}
mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为\redbf{密码}，也叫\redbf{三联子密码}即密码子(codon)。

翻译时从\redbf{起始密码子AUG(initiation codon)}开始，沿着mRNA5'——3'的方向连续阅读密码子，直至\redbf{终止密码子(termination codon)}为止，生成一条具有特定序列的多肽链————\redbf{蛋白质}。

新生的多肽链中氨基酸的组成和排列顺序决定于其基因的碱基组成及其顺序，蛋白质最终是\redbf{受基因控制的}。

贮存在DNA上的遗传信息通过\redbf{mRNA}传递到蛋白质上，mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。

遗传密码是20世纪60年代通过设计出色的生物化学和遗传学实验阐明的，它是科学上的杰出成就之一，它不仅为研究蛋白质的生物合成提供了理论依据，也证实了\redbf{中心法则}的正确性。
\subsection{三联密码子及其破译}
遗传密码的破译，即确定代表每种氨基酸的具体密码。

蛋白质中的氨基酸序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的，所以，要知道它们之间的关系就要弄清核苷酸和氨基酸数目的对应关系。

\bluebf{用核苷酸的插入或删除实验证明mRNA模板上每3个核苷酸组成一个密码子}

\subsubsection{以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成}

认定UUU代表苯丙氨酸(Phe)。以多(C)及多(A)做模板得到的分别是多脯氨酸和多赖氨酸，这样很快就解决了3个氨基酸的密码子。

\subsubsection{核糖体结合技术}
1964年Nirenberg和Leder又采用核糖体和三联体结
合实验:
\begin{itemize}
    \item tRNA-氨基酸，三联体密码子及核糖体的结合是特异的；
    \item 上述结合的复合体不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而RNA-氨基酸的复合体可以通过。
\end{itemize}
\subsection{遗传密码的性质}
\begin{enumerate}
    \item \redbf{密码的连续性}:翻译由mRNA的\bluebf{5'端的起始密码子}开始，一个密码子接一个密码子连续阅读直到\bluebf{3'终止密码}，密码间无间断也没有重叠，即起始密码子决定了所有后续密码子的位置，说明三联子密码是连续的。
    \item \redbf{密码的简并性}
    \begin{itemize}
        \item 按照1个密码子由3个核苷酸组成的原则，4核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其中61个是编码氨基酸的密码子，另外3个即UAA、UGA和UAG并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与RNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。
        \item 因为存在61种密码子而只有20种氨基酸，所以许多氨基酸有多个密码子，实际上除\bluebf{甲硫氨酸(AUG)和色氨酸(UGG)只有一个密码子}外，其他氨基酸都有一个以上的密码子。
        \item 细菌中3种终止密码子的使用频率是不同的，UAA是最常用的，UGA比UAG的使用频率更高一点，但UGA出错的可能性更大一些。
        \item 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为\redbf{简并}。对应于同一氨基酸的密码子称为\redbf{同义密码子}。
    \end{itemize}
    \item \redbf{密码的通用性与特殊性}:密码子具有通用性:遗传密码适用各种生物。
    \begin{itemize}
        \item 虽然密码子具有通用性，但也发现极少数例外:
        \item 支原体:终止密码子UGA编码色氨酸；嗜热四膜虫:终止密码子UAA 编码谷氨酰胺；
    \end{itemize}
\end{enumerate}
\begin{kaobox}
简并密码的生物学意义：
\begin{itemize}
    \item 同义密码子一般都不是随机分布的，因为其第一、第二位核苷酸往往是相同的，而第三位核苷酸的改变并不一定影响所编码的氨基酸，\redbf{这种安排减少了变异对生物的影响}。
    \item 简并性除了能降低突变所造成的损害外，还可\redbf{减少所需的RNA种类}。编码密码子共有61种，但并不需61种RNA。
    \item \redbf{密码子的专一性主要由前两个碱基决定}，这对保证物种稳定性有一定意义，并可以减少突变影响。但并不是所有的简并性都是前两个核苷酸相同，如有6个密码子的\redbf{Leu、Arg、Ser}的前两个核苷酸并不全都相同。
\end{itemize}
\end{kaobox}
\subsection{密码子与反密码子的相互作用}
在蛋白质生物合成过程中，RNA的反密码子在核糖体内是通过\redbf{碱基的反向配对与mRNA上的密码子相互作用的}。

\redbf{摆动假说}:即在密码子与反密码子配对时，第三个碱基允许有一定的自由度，也叫变偶假说。

\section{tRNA}
tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了\redbf{接合体}，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了\redbf{运送载体}，所以，它又被称为\redbf{第二遗传密码}。

\subsection{tRNA的三叶草二级结构}
\redbf{受体臂(acceptor arm)}因结合氨基酸的位点而得名，主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3'端未配对的3~4个碱基所组成，其\redbf{3'端}的最后3个碱基序列永远是CCA序列，伸出双链之外，最后一个碱基的3'或2'自由羟基(-OH)可以被氨酰化。

\redbf{其余手臂}均由碱基配对产生的杆状结构和无法配对的套索状结构所组成。

\redbf{T$\psi $C臂}是根据3个核苷酸命名的，其中$\psi $表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。

\redbf{反密码子臂}是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。反密码子的两端由5’端的尿嘧啶和3’端的嘌呤界定。

\redbf{D臂}是根据它含有二氢尿嘧(dihydrouracil)命名的。

\subsubsection{tRNA的分子长度}
在D臂中存在多至3个可变核苷酸位点。RNA分子中最大的变化发生在位于T$\psi $C和反密码子臂之间的\redbf{多余臂(extra arm)}上。
\subsubsection{tRNA的稀有碱基}
RNA的稀有碱基含量非常丰富，有70余种。每个RNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3'端邻近部位出现的频率最高，且\redbf{大多为嘌呤核苷酸}，这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对很重要。

所有的RNA都能够与核糖体的A位点(新进氨酰NA的结合位点)和P位点(肽酰RNA的结合位点)结合，

此时，BNA分子三叶草型顶端突起部位通过密码子-反密码子的配对与mRNA相结合，而其3端恰好将所运转的氨基酸送到正在延伸的多肽上。

\subsection{tRNA的L型三维结构}
在二级结构基础上分析酵母tRNA$^{Phe}$、tRNAf$^{Met}$和大肠杆菌RNAf$^{Met}$、tRNA$^{Arg}$等的三级结构，发现都呈L形折叠，这种结构是靠氢键来维持的。

\redbf{tRNA的三级结构与AA-tRNA合成酶对tRNA的识别有关}。

tRNA高级结构的特点为研究其生物学功能提供了重要线索，tRNA上所运载的氨基酸必须靠近核糖体大亚基上的\redbf{多肽合成位点}，反密码子必须与\redbf{小亚基}结合的mRNA配对，分子中两个不同的功能基团是最大限度分离的。

\redbf{tRNA的性质是由反密码子而不是它所携带的氨基酸所决定的}。
\subsection{tRNA的功能}
氨基酸在合成蛋白质之前必须通过\redbf{AA-RNA合成酶}活化，在消耗ATP的情况下结合到RNA上，生成有\redbf{蛋白质合成活性的AA-tRNA}。(受体臂)

通过RNA上的反密码子与mRNA上密码子相互识别配对，才能被带到\redbf{mRNA-核糖体复合物}上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上。(反密码子臂)

\begin{kaobox}
起识别作用的是tRNA而不是氨基酸实验证据:

$^{14}$C标记的半胱氨酸与tRNACys结合后生成[$^{14}$C]-半胱氨酸-tRNA$^{Cys}$，经Ni催化可生成[$^{14}$C]-Ala-tRNA$^{Cys}$，再把[$^{14}$C]-Ala-tRNA$^{Cys}$加进含血红蛋白mRNA、其他RNA、氨基酸以及兔网织细胞核糖体的蛋白质合成系统中，结果发现[$^{14}$C]-Ala-tRNA$^{Cys}$插入了血红蛋白分子通常由半胱氨酸占据的位置上。

(\redbf{本质:Ala丙氨酸利用tRNA$^{Cys}$替换了Cys氨基酸的位置})
\end{kaobox}
\subsection{tRNA的种类}
\subsubsection{起始RNA和延伸RNA}
能\redbf{特异地识别mRNA上起始密码子的RNA叫起始RNA}，其他tRNA统称为\redbf{延伸RNA}。

\redbf{原核生物}起始RNA携带\redbf{甲酰甲硫氨酸fMet}，\redbf{真核生物}起始tRNA携带\redbf{甲硫氨酸Met}。原核生物中Met-tRNAMet首先甲酰化生成fMet-tRNAfMet才能参与蛋白质的生物合成。
\subsubsection{同工RNA}
将\redbf{几个代表相同氨基酸的tRNA称为同工RNA(cognateRNA)}。同工tRNA组内所有tRNA均专一于相同的氨酰tRNA合成酶。

同工tRNA既要有不同的\redbf{反密码子}识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种\redbf{结构上的共同性}，能被AA-tRNA合成酶识别。
\subsubsection{校正tRNA}
结构基因中一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质合成\redbf{提前终止}，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变称为\redbf{无义突变}(nonsense mutation)，而无义突变的\redbf{校正tRNA}可通过改变反密码子区校正无义突变。

\redbf{错义突变}(missense mutation)的\redbf{校正tRNA}可通过\redbf{反密码子区的改变}把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。

校正tRNA在进行校正过程中必须\redbf{与正常的tRNA竞争结合密码子}。无义突变的校正tRNA必须与\bluebf{释放因子}竞争识别密码子，错义突变的校正tRNA必须与该密码的\bluebf{正常tRNA竞争}，都会影响校正的效率。

缺点：
\begin{itemize}
    \item \redbf{无义突变的校正}基因tRNA不仅能校正无义突变，也会抑制该基因3'端正常的终止密码子，导致翻译过程的通读，合成更长的蛋白质，这种蛋白质过多就会对细胞造成伤害。
    \item 一个基因\redbf{错义突变的校正}tRNA也可能使另一个基因错误翻译，因为一个校正基因也可以在另一位点通过取代一种氨基酸的方式在正常位点上引入新的氨基酸。
\end{itemize}
\subsection{氨酰tRNA合成酶}
氨酰tRNA合成酶是一类\redbf{催化氨基酸连接于tRNA的3'端的特异性酶}。

氨酰tRNA合成酶(AA-tRNA synthetase)确保了tRNA只与正确的氨基酸相偶联。

包括两步反应:

第一步是\redbf{氨基酸活化}生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。

第二步是\redbf{氨酰基转移}到RNA3'端腺苷残基的2'或3-羟基上。

\redbf{AA-tRNA合成酶}既要能识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。

AA-tRNA合成酶通过对所对应的tRNA独特结构的识别来保证翻译的正确进行。

受体臂是AA-tRNA合成酶识别特异性的关键因素。
\begin{kaobox}
    AA-tRNA合成酶特异性：

    异亮氨酸比缬氨酸只多一个甲烯基团，而\redbf{异亮氨酰tRNA}合成酶对异亮氨酸的亲和力比对缬氨酸大225倍。研究发现，异亮氨酰tRNA合成酶在催化部位附近还有一个编辑部位，对腺苷酰基化产物进行校对。被错误活化的缬氨酸不会被结合到tRNA$^{Ile}$上，而是被酶本身水解，\redbf{活化阶段产生的误差在后一个阶段会被校正}。
\end{kaobox}
\section{核糖体}
核糖体是指导蛋白质合成的大分子机器，是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA(，rRNA)组成的亚细胞颗粒。

\subsection{核糖体的结构}
\subsubsection{核糖体包括两个亚基}
原核生物核糖体由约$\frac{2}{3}$ 的RNA及$\frac{1}{3}$的蛋白质组成。

大亚基约为小亚基相对分子质量的两倍。

\begin{equation*}
\text{原核生物70S的核糖体}
        \begin{cases}
            \text{大亚基：50S}
            \begin{cases}
                \text{rRNA：23S rRNA、5S rRNA}\\
                \text{蛋白质：36种}\\
            \end{cases}\\
            \text{小亚基：30S}
            \begin{cases}
                \text{rRNA：16S rRNA}\\
                \text{蛋白质：21种}\\
            \end{cases}
        \end{cases}
\end{equation*}

\begin{equation*}
\text{真核生物80S的核糖体}
        \begin{cases}
            \text{大亚基：60S}
            \begin{cases}
                \text{rRNA：28S 、5.8S 、5S rRNA}\\
                \text{蛋白：49种}\\
            \end{cases}\\
            \text{小亚基：40S}
            \begin{cases}
                \text{rRNA：18S rRNA}\\
                \text{蛋白质：33种}\\
            \end{cases}
        \end{cases}
\end{equation*}
真核生物核糖体由约3/5的RNA及2/5的蛋白质组成。
\subsubsection{核糖体蛋白质}
核糖体上有多个活性中心，每个中心都由一组特殊的\redbf{核糖体蛋白质}(ribosomal protein, r-protein, r- 蛋白)构成。有些蛋白质本身具有催化功能，但若将它们分离，
催化功能就会完全消失。所以，核糖体是一个许多酶的集合体。

核糖体60S大亚基的\redbf{蛋白L11} (ribosomal protein L11,RPL11)具有调节抑癌蛋白p53及癌蛋白c-Myc活性功能等作用。

三维结构证明\redbf{肽基转移中心}完全是由RNA组成的。核糖体分子可容纳两个tRNA和约40 bp长的mRNA。

\subsubsection{核糖体RNA}
\begin{itemize}
    \item 5S rRNA： 有两个高度保守的区域，其中一个区域含有保守序列\redbf{CGAAC}，是与tRNA TψC
环相互作用相互识别的部位。另一个区域含有保守序列\redbf{GCGCCGAAUGGUAGU}，与23S rRNA的一段序列互补，是5S rRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点，在结构上有其重要性。\bluebf{（与tRNA相互识别+23S rRNA互补结合）}；
    \item \redbf{16S rRNA} ： 结构十分保守 ， 3′ 端 一 段\redbf{ACCUCCUUA}的保守序列，与mRNA 5′端翻译起始区富含嘌呤的序列互补。3′端处还有一段与23S rRNA互补的序列，在30S与50S亚基的结合中起作用。\bluebf{（与mRNA 5′互补+23S rRNA互补结合）}；
    \item \redbf{5.8S rRNA}：真核生物核糖体大亚基特有，含有能够与tRNA作用的识别序列，可能与原核生物的5SrRNA 具有相似的功能。；
    \item \redbf{23S rRNA}： 能催化肽键的形成。与处于A和P位点的tRNA的CCA末端之间的碱基配对，帮助氨酰tRNA的α氨基基团攻击结合于肽酰tRNA多肽上的羰基，并稳定入位后的氨酰tRNA(肽酰转移酶活性)；
    \item \redbf{18S rRNA}：3′ 端与大肠杆菌16SrRNA有广泛的同源性。
    \item \redbf{28S rRNA}：目前还不清楚该rRNA的功能。
\end{itemize}
\subsubsection{核糖体tRNA的结合位点}
\begin{itemize}
    \item \redbf{A位点}(氨酰tRNA结合位点)：新进\redbf{氨酰tRNA}的结合位点。
    \item \redbf{P位点}(肽酰tRNA结合位点)：肽链延伸过程中\redbf{肽酰tRNA}的结合位点。
    \item \redbf{E位点}(离开tRNA结合位点)：即去氨酰tRNA通过E位点脱出，被释放到核糖体外的细胞质中去。
\end{itemize}
\subsection{核糖体的功能}
\begin{enumerate}
    \item 核糖体包括\redbf{多个活性中心}(至少5个)，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位(A位)、结合或接受肽酰tRNA 的部位(P位)、肽基转移部位及形成肽键的部位(转肽酶中心)。此外，还有负责肽链延伸的\redbf{各种延伸因子的结合位点}。
    \item \greenbf{核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别}，如起始部分的识别、密码子与反密码子的相互作用等，mRNA的结合位点也在此亚基上。
    \item \greenbf{大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能}，包括肽键的形成、AA-tRNA、肽酰tRNA 的结合等。
\end{enumerate}
\section{蛋白质合成的生物学机制}
蛋白质的生物合成包括\redbf{氨基酸活化，肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工}。

\subsection{氨基酸的活化}
氨基酸必须在氨酰tRNA 合成酶的作用下生成\redbf{活化氨基酸—AA-tRNA}。

至少存在20种以上具有\redbf{氨基酸专一性的氨酰tRNA合成酶}，能够识别并通过氨基酸的羧基与tRNA 3′端腺苷酸核糖基上3′-OH缩水形成二酯键。同一氨酰tRNA合成酶具有把相同氨基酸加到带有不同反密码子tRNA分子上的功能。

细菌的起始氨基酸是\redbf{甲酰甲硫氨酸}，与核糖体小亚基相结合是\redbf{N-甲酰甲硫氨酰tRNA$^{fMet}$}。

真核生物中任何一个多肽合成都是从生成\redbf{甲硫氨酰tRNA$^{iMet}$}开始的，因为甲硫氨酸的特殊性，所以体内存在两种tRNA$^{Met}$。只有\redbf{甲硫氨酰tRNA$^{iMet}$}才能与40S小亚基相结合，起始肽链合成，普通tRNA$^{Met}$中携带的甲硫氨酸只能被掺入正在延伸的肽链中。

\subsection{肽链的起始}
蛋白质合成的起始需要核糖体大、小亚基，起始tRNA和几十个蛋白因子的参与，在模板mRNA
编码区5′端形成\redbf{核糖体-mRNA-起始tRNA复合物}并将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位点。

原核生物的起始tRNA 是\redbf{fMet-tRNA$^{fMet}$}，真核生物是\redbf{Met-tRNA$^{iMet}$}。

原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNA$^{fMet}$结合，最后与50S大亚基结合。

真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNA$^{iMet}$结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNA$^{iMet}$起始复合物。

\subsubsection{原核生物肽链的起始}
\begin{itemize}
    \item 70S核糖体在\redbf{IF-1}，\redbf{IF-3}影响下解离成30S和50S两个亚基。在\redbf{IF-1}因子帮助下，30S亚基与\redbf{IF-3}结合，再在\redbf{SD序列}的帮助下与\redbf{mRNA模板}结合。
    \item 在\redbf{IF-2}和\redbf{GTP}的帮助下，\redbf{fMet-tRNA$^{fMet}$}进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。
    \item GTP水解，释放翻译起始因子，带有tRNA，mRNA的小亚基复合物与50S大亚基结合。
\end{itemize}
\redbf{30S亚基}具有专一性的识别和选择mRNA起始位点的性质，而\redbf{IF-3}能协助该亚基完成这种选择。

几乎所有原核生物mRNA上都有一个5'-AGGAGGU-3’序列这个富嘌呤区被命名为\redbf{SD序列}(Shine-Dalgarno sequence)，它与30S亚基上16SrRNA3’端的富嘧啶区序列5-GAUCACCUCCUUA-3'相互补。

只有\redbf{fMet-tRNA$^{fMet}$}能与第一个P位点相结合，其他所有RNA都必须通过A位点到达P位点，再由E位点离开核糖体。(进入肽链延伸)
\subsubsection{真核生物肽链的起始}
\begin{kaobox}
    真核生物蛋白质翻译的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是：
\begin{enumerate}
    \item 核糖体较大，有较多的\redbf{起始因子}参与；
    \item 其mRNA具有m$^7$GpppNp帽子结构，“帽子”和\redbf{3’端的多聚A}都参与形成翻译起始复合物(环化)；
    \item 需要消除二级结构
    \item Met-tRNA$^{Met}$不甲酰化;
    \item 小亚基对mRNA上的起始密码子AUG的识别靠“滑动搜索模型”9mRNA5’端与18SrRNA的3’端序列之间存在不同于SD 序列的碱基配对型相互作用;
    \item 40S亚基先于Met-tRNA$^{Met}$结合形成\redbf{43S复合物}。
\end{enumerate}
\end{kaobox}

真核生物起始复合物的形成，\redbf{帽子结构}能促进起始反应，因为核糖体上有专一位点或因子识别mRNA的帽子，使mRNA与核糖体结合。帽子在mRNA与40S亚基结合过程中还起稳定作用。

有些带帽子的mRNA5’端存在一个\redbf{共同序列(5’-CCRCCAUGG-)}与18S rRNA的3'端序列之间存在碱基配对作用。

\redbf{eIF4E}是帽子结合蛋白(eIF-4E)，能专一地识别mRNA的帽子结构，与mRNA的5’端结合生成蛋白质-mRNA复合物。利用该复合物对eIF-3的亲和力与含有eIF-3的\redbf{40S亚基}结合。

扫描模型：
\begin{itemize}
    \item 40S小亚基先识别在mRNA的5’端的甲基化帽子，然后沿mRNA移动，当40S小亚基遇到AUG时，由于Met-tRNA$^{iMet}$反密码子与AUG配对，导致移动暂停。
    \item 存在于-4位和+1位的碱基对于AUG是否被识别为起始密码子具有重要的影响。在AUG之前的第三个嘌呤(G或A)以及紧跟其后的G，可以显著影响翻译效率。\redbf{(Kozak序列)}
    \item 60S亚基与40S复合物结合生成\redbf{80S起始复合物}。在第一个40S亚基离开起始点之前，会有更多的小亚基识别5'端，形成40S亚基的队列。
\end{itemize}
\subsection{肽链的延伸[important]}
肽链延伸是由许多个这样的反应组成的
\begin{enumerate}
    \item 原核生物中每次反应共需3个延伸因子，\redbf{EF-Tu、EF-Ts及EF-G}，它们都具有GTP酶的活性，EF-Tu和EF-Ts能够促进AA-tRNA进入A位，EF-G则促进移位和卸载RNA的释放。
    \item \redbf{真核生物细胞}需\redbf{EF-1}(对应于EF-Tu和EF-Ts)及\redbf{EF-2}(相当于EF-G)，消耗2个GTP，向生长中的肽链加上一个氨基酸。
\end{enumerate}



蛋白质合成的延伸机制在\redbf{原核细胞和真核细胞}是非常相似的。

起始复合物生成，第一个氨基酸与核糖体结合以后，肽链按照mRNA模板密码子的排列氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。

肽链延伸包括:\redbf{AA-tRNA与核糖体结合(进位)、肽键的生成(转肽)和移位}。
\subsubsection{后续AA-tRNA与核糖体结合（进位）}
起始复合物形成以后，第二个AA-tRNA在延伸因子\redbf{EF-Tu}及GTP的作用下，生成AA-tRNA·EF-Tu·GTP复合物，然后结合到核糖体的\redbf{A位}上。

这时GTP被水解释放，通过延伸因子\redbf{EF-Ts}再生GTP，形成EF-Tu·GTP复合物，进入新一轮循环。

模板上的\redbf{密码子}决定了哪种AA-tRNA能被结合到A位上。

\begin{kaobox}
为什么肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸？

因为EF-Tu只能与fMet-tRNA以外的其他AA-tRNA起反应，所以起始RNA不会被结合到A位上，这就是mRNA内部的AUG不会被起始NA读出，肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸的原因。
\end{kaobox}
\subsubsection{肽链的形成（转肽）}
经过上一步反应后，在核糖体·mRNA·AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNA$^{fMet}$占据P位。在肽基转移酶(peptidyltransferase)的催化下，\redbf{A位上的AA-tRNA与fMet-tRNA$^{fMet}$上的氨基酸生成肽键}。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。
\subsubsection{肽链的移位}
肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向mRNA3'端方向移动一个密码子。核糖体通过\redbf{EF-G}介导的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3'端移动一个密码子，使二肽酰tRNA$_2$完全进入P位，此时，仍与第二个密码子相结合的二肽酰RNA$_2$从A位进入P位，去氨酰tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。
\subsection{肽链的终止}
当\redbf{终止密码子UAA、UAG或UGA}出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合

而\redbf{释放因子(release factor，RF)}能识别这些密码子并与之结合

水解P位上多肽链与tNA之间的二酯键。新生的多肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。

释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。

释放因子有两类:\redbf{I类释放因子}识别终止密码子，并能催化新合成的多肽链从P位点的RNA中水解释放出来;\redbf{II类释放因子}在多肽链释放后刺激I类释放因子从核糖体中解离出来。

\subsubsection{释放因子}
\begin{kaobox}
\vem
\begin{enumerate}
    \item \redbf{原核细胞}内存在3种不同的释放因子\redbf{(RF1、RF2、RF3)}，\redbf{RF1和RF2为I类释放因子}。RF1识别UAG和UAA，RF2识别UGA和UAA。一旦RF与终止密码相结合，\redbf{诱导肽基转移酶把一个水分子加到延伸的肽链上}。RF3为II类释放因子，与核糖体的解体有关。
    \item \redbf{真核细胞}的释放因子只有\redbf{eRF1和eRF3}。I类释放因子eRF1能够识别3个终止密码子。
\end{enumerate}
\end{kaobox}
\subsubsection{核糖体循环}
\begin{itemize}
    \item mRNA和起始tRNA结合在小亚基上，随后小亚基-mRNA复合物随后吸引大亚基结合，形成完整的、结合有mRNA的核糖体，蛋白质合成开始。\redbf{（起始）}
    \item 核糖体从一个密码子移位到另一个密码子，活化tRNA 进入核糖体的解码和肽基转移酶中心。\redbf{（延伸）}
    \item 核糖体遇到终止密码子，已合成的多肽链被释放出来，核糖体大、小亚基分离。\redbf{（终止）}
    \item 已分离的亚基就可以结合到新的mRNA分子上，开始下一轮蛋白质合成的循环。
\end{itemize}
\subsection{多核核糖体和蛋白质的合成}
虽然一个核糖体一次只能合成一条多肽，但每个mRNA分子却能同时被多个核糖体结合同时进行翻译。结合多个核糖体的mRNA称为\redbf{多核糖体(polysome)}。

意义：这种多重起始意味着在短时间内一条mRNA能够被高效地翻译，合成数量更多的蛋白质分子。

mRNA链上一般每80个核苷酸结合一个核糖体。多(A)尾结合蛋白与eIF-4G亚基相互作用促进mRNA的环化，提高翻
译效率，\redbf{一个mRNA分子同时指导多个多肽链的合成}。\redbf{细菌中的蛋白质合成效率更高。}

\subsection{蛋白质的前体加工}
新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加
工修饰才能转变为有活性的蛋白质。
\subsubsection{N端fMet或Met的切除}
细菌蛋白质氨基端的甲酰基能被\redbf{脱甲酰化酶}水解，不管是原核生物还是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。
\subsubsection{二硫键的形成}

不少蛋白质都含有二硫键，这是蛋白质合成后通过\redbf{两个半胱氨酸的氧化作用}生成的。

\redbf{二硫键的正确形成对稳定蛋白的天然构象具有重要的作用。}
\subsubsection{特定氨基酸修饰}
氨基酸侧链的修饰作用包括\redbf{磷酸化}(如核糖体蛋白质)、\redbf{糖基化}(如各种糖蛋白)、\redbf{甲基化}(如组蛋白、肌肉蛋白质)、\redbf{乙酰化}(如组蛋白)、\redbf{泛素化}(多种蛋白质)等。
\begin{itemize}
    \item \redbf{磷酸化}：主要由多种蛋白激酶催化，发生在\redbf{丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸}等3种氨基酸的侧链。
    \item \redbf{糖基化}：是真核细胞蛋白质的特征之一。大多数糖基化是由\redbf{内质网中的糖基化酶(glycosylase)}催化进行的。所有的\redbf{分泌蛋白和膜蛋白}几乎都是糖基化蛋白质。
    \item \redbf{甲基化}：是由甲基转移酶催化的。甲基化包括发生在\redbf{Arg、His和Gln}的侧基的N-甲基化以及\redbf{Glu和Asp}侧基的O-甲基化。
    \item \redbf{乙酰化}：发生在赖氨酸侧链上的ε-NH2，由乙酰基转移酶催化。
    \item \redbf{泛素化和类泛素化修饰}：发生在赖氨酸残基侧链上，由E1、E2 和E3一系列酶催化。
\end{itemize}
\subsubsection{切除新生肽链中的非功能片段}
新合成的胰岛素前体是\redbf{前胰岛素原}，必须先切去信号肽变成\redbf{胰岛素原}，再切去\redbf{中间肽}，才变成有活性的胰岛素。

\subsection{蛋白质的折叠}
由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成\redbf{动力学和热力学稳定的三维构象}，从而表现出生物学活性或功能。因此，可以说蛋白质折叠是翻译后形成功能蛋白质的必经阶段。

新生多肽一般首先折叠成二级结构，然后再进一步折叠盘绕成三级结构。
\subsubsection{分子伴侣}
分子伴侣是能够在细胞内\redbf{辅助新生肽链正确折叠}的蛋白质。

它是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，它们在细胞内能\redbf{帮助其他多肽进行正确的折叠、组装、运转和降解}。

细胞内有两类分子伴侣家族，即\redbf{热休克蛋白家族和伴侣素}。

\redbf{热休克蛋白}:是一类应激反应性蛋白，包括HSP70、HSP40 和GrpE3个家族，广泛存在于原核及真核细胞中。

\redbf{伴侣素}:包括HSP60和HSP10(原核同源物为GroEL和GroES)，为非自发性折叠蛋白提供能折叠形成天然结构的微环境。

分子伴侣在新生肽链折叠中主要通过防止或消除肽链的错误折叠，增加功能性蛋白质折叠产率来发挥作用，而并非加快折叠反应速度。

\bluebf{分子伴侣本身并不参与最终产物的形成。}
\subsection{蛋白质合成的抑制剂}
抗菌素对蛋白质合成的作用:
\begin{itemize}
    \item 阻止mRNA与核糖体结合(\redbf{氯霉素})
    \item 阻止AA-tRNA与核糖体结合(\redbf{四环素类})
    \item 干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读(\redbf{链霉素、新霉素、卡那霉素等})
    \item 作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。
\end{itemize}
\subsubsection{链霉素}
链霉素是一种碱性三糖，可以多种方式抑制原核生物核糖体，能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始;也会导致mRNA的错读。作用位点在30S亚基。

\subsubsection{嘌呤霉素}
嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，不需要延伸因子就可以结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入。

\redbf{嘌呤霉素是通过提前释放肽链来抑制蛋白质合成的。}
\section{蛋白质转运机制}
一般说来，蛋白质运转可分为两大类:\redbf{翻译运转同步机制和翻译后运转机制}。
\begin{itemize}
    \item \redbf{翻译运转同步机制}：蛋白质的合成和运转是同时发生的；
    \item \redbf{翻译后运转机制}：蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。
    \item \redbf{分泌蛋白}大多以翻译运转同步机制运输的。
    \item \redbf{细胞器定位蛋白}大多以翻译后运转机制运输的。
    \item \redbf{参与生物膜形成的蛋白质}，则依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。
\end{itemize}
\subsection{翻译运转同步机制}
\subsubsection{信号肽}
一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达，这就是\redbf{信号肽假说}的基础。

信号肽假说认为，\redbf{蛋白质跨膜运转信号也是由mRNA编码的}。

在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列就被称为\bluebf{信号序列}。

信号序列在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构，因此，这种方式是\redbf{边翻译边跨膜运转}。

\subsubsection{信号肽序列的特点}

\begin{itemize}
    \item 该序列常常位于蛋白质的N端，长度一般为13~36个残基
    \item 一般带有10~15个\redbf{疏水氨基酸}
    \item 在靠近该序列N端常常有1个或数个\redbf{带正电荷的氨基酸}
    \item 在其C端靠近蛋白酶切割位点处带有数个\redbf{极性氨基酸}，离切割位点最近的往往是短的侧链氨基酸(丙氨酸或甘氨酸)
\end{itemize}
\subsubsection{新生肽向内质网内腔运转过程}
SRP(信号识别蛋白)和DP(停靠蛋白，又称SRP受体蛋白)介导了蛋白质的跨膜运转过程。

\begin{itemize}
    \item SRP能同时识别正在合成需要通过内质网膜进行运转的新生肽和自由核糖体，\redbf{它与这类核糖体上新生蛋白的信号肽结合是多肽正确运转的前提}，但同时也导致了该多肽合成的暂时终止(此时新生肽一般长约70个残基)；
    \item SRP-信号肽-多核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP的受体————DP相结合。
    \item \redbf{只有当SRP与DP相结合时，多肽合成才恢复进行}，信号肽部分通过膜上的核糖体受体及蛋白运转复合物跨膜进入内质网内腔，新生肽链重新开始延伸。
    \item \redbf{整个蛋白质跨膜以后，信号肽被水解，形成高级结构和成熟型蛋白质}，并被运送到相应细胞器。
\end{itemize}
\subsubsection{信号肽在蛋白质运输过程中发挥如下作用}
\begin{itemize}
    \item \redbf{完整的信号多肽是保证蛋白质运转的必要条件}。信号序列中疏水性氨基酸突变成亲水性氨基酸，会阻止蛋白运转而使新生蛋白质以前体形式积累在胞质中。
    \item \redbf{仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生}。要使蛋白质顺利跨膜，还要求运转蛋白在信号序列以外的部分有相应的结构变化。
    \item \redbf{信号序列的切除并不是运转所必需的}。如果把细菌外膜脂蛋白信号序列中的甘氨酸残基突变成天冬氨酸残基，能抑制该蛋白信号肽的水解，但不能抑制其跨膜运转。
    \item \redbf{并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽}。卵清蛋白是以翻译运转同步机制进入微粒体中的，但它并没有可降解的信号序列。据此，“信号肽”应当定义为:能启动蛋白质运转的任何一段多肽。
\end{itemize}
\subsection{翻译后运转机制}
研究发现，\redbf{叶绿体和线粒体}中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。

\subsubsection{线粒体蛋白跨膜转运}
大部分线粒体蛋白质都是由核DNA编码，在细胞质核糖体上合成，被释放至细胞质后，再跨膜运转到线粒体各部分。

\begin{itemize}
    \item 通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由\redbf{成熟蛋白质}和位于N 端的一段前导肽(leaderpeptide)共同组成。当前体蛋白过膜时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解，释放成熟蛋白质。
    \item \redbf{蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需要能量的过程}。
    \item 蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的\redbf{Tom受体复合蛋白}识别与HSP70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。
    \item \redbf{蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒HSP70引发的ATP水解和膜电位差}。
\end{itemize}
\subsubsection{前导肽的作用和性质}
拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。因此，前导肽对线粒体蛋白质的识别和跨膜运转起着关键作用。

前导肽一般有以下几个特点：
\begin{itemize}
    \item 带\redbf{正电的碱性氨基酸}含量较为丰富，分散于不带电荷的氨基酸序列间(起重要作用)；
    \item 缺少\redbf{带负电的酸性氨基酸}；
    \item \redbf{丝氨酸}含量较高；
    \item 有\redbf{形成$\alpha$-螺旋结构的能力}。
\end{itemize}
并非线粒体蛋白质前体都共用一种受体，但\redbf{Tom受体}可能是线粒体蛋白质跨膜运转时最主要的受体蛋白。

\subsubsection{叶绿体蛋白跨膜转运}
叶绿体定位信号肽一般有两个部分，第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白质能否进入类囊体。

\subsection{核定位蛋白的转运机制}
在细胞质中合成的蛋白质一般通过\redbf{核孔}进入细胞核。所有\redbf{核糖体蛋白}首先在细胞质中合成，\redbf{运转到细胞核内}，在核仁中装配成40S和60S核糖体亚基，然后运转回到细胞质中行使作为蛋白质合成机器的功能。

真核细胞核膜上的\redbf{核孔复合体}(nulcear pore complex，NPC)是细胞核内外进行物质交换的主要通道，相对分子质量较小的蛋白质可自由通过NPC或采取被动扩散的方式进入细胞核，而相对分子质量大于4X104的蛋白质则需要通过主动运转进出细胞核。

进出细胞核的蛋白质需要在其氨基酸序列上带有特殊的\redbf{核定位信号序列}(NLS,nuclear localization signal)和\redbf{出核信号序列}(NES，nuclear export signal)，才能被相应的核运转蛋白识别。NLS可以位于核蛋白的任何部位，也能够引导其他非核蛋白进入细胞核。

核定位信号都具有一个\redbf{带正电荷的肽核心}，通常是一短的富含碱性氨基酸的序列，它能与入核载体相互作用，将蛋白质运进细胞核。

入核信号与前导肽的区别在于
\begin{itemize}
    \item \redbf{由含水的核孔通道来鉴别}
    \item 入核信号是蛋白质的永久性部分，在引导入核过程中，并不被切除，有利于细胞分裂后核蛋白重新入核。
\end{itemize}
蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子包括\redbf{核运转因子(importin)$\alpha$、$\beta$} 和一个低相对分子质量\redbf{GTP酶(Ran)}参与。

\redbf{$\alpha $和$\beta $组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是$\alpha$亚基。}

由上述3个蛋白质组成的\redbf{复合物}停靠在核孔处，依靠\redbf{RanGTP酶水解GTP}提供的能量进入细胞核，$\alpha$和$\beta$亚基解离，核蛋白与$\alpha$亚基解离，$\alpha$和$\beta$分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。

经典的\redbf{出核信号序列(NES)}是由疏水性氨基酸尤其是亮氨酸和异亮氨酸富集的区域构成，其\redbf{保守性氨基酸排序}为$\Phi X_{1~3}\Phi X_{2~3}\Phi X\Phi$，其中，$\Phi$代表疏水性氨基酸L、I、F或M，而X代表任意氨基酸。

经典的NES大多为CRM1 依赖性，它能够被\redbf{出核因子CRM1 /exporting/Xpo1} 识别并结合，从而携带该蛋白质出核。
\section{蛋白质的修饰、降解与稳定性研究}
在大肠杆菌中，蛋白质的降解是通过\redbf{依赖于ATP的蛋白酶(称为Lon)}来实现的。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，该酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一个肽键要消耗\redbf{两个分子的ATP}。
\subsection{泛素化修饰介导的蛋白质降解}
在真核生物中，除了通过\redbf{溶酶体以及自噬通路}，蛋白质的降解主要依赖于\redbf{泛素蛋白(ubiquitin)}。

\redbf{泛素化指在泛素激活酶、结合酶、连接酶等}的作用下，泛素C端甘氨酸残基通过酰胺键与底物蛋白的赖氨酸残基的$\sigma$氨基结合，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。

\redbf{泛素只有76个氨基酸残基，序列高度保守(从酵母和人细胞中的泛蛋白几乎完全相同)}。

泛素化修饰涉及\redbf{泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3}等3个酶的级联反应:首先在ATP提供能量的情况下，泛素激活酶E1黏附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素，E1酶再将激活的泛素分子转移到泛素结合酶E2上，再由E2酶和一些种类不同的泛素连接酶E3酶共同识别靶蛋白，对其进行泛素化修饰。

底物泛素化修饰的\redbf{特异性是由连接酶E3决定}的，可以对靶蛋白进行单泛素化和多泛素化修饰。


蛋白质的泛素化修饰是翻译后修饰的一种常见形式，该过程能够调节不同细胞途径中的各种蛋白质。其中，\redbf{泛素-蛋白酶体途径}是最先被发现的，也是一种较普遍的内源蛋白质降解方式。

蛋白酶体(proteasome)因其密度梯度离心沉降系数为26S，故又称其为\redbf{26S蛋白酶体}。

蛋白酶体是由1个20S 催化颗粒(CP/RP)和2个19S调节颗粒(RP)组成的桶状结构。一旦底物蛋白被多泛素化(至少4个泛素分子)，它或者直接与19S调节颗粒上的泛素受体结合，或者通过\redbf{19S调节颗粒上的adaptor受体}间接结合到蛋白酶体，然后被剪切成小的肽段而降解，泛素会被再利用。

\redbf{并非所有泛素化修饰都会导致蛋白质降解}。有些泛素化修饰还能参与多种生物功能的调控。

\subsection{蛋白质的SUMOylation}
除了泛素化修饰，细胞内还有一些与泛素化修饰相类似的反应，称为\redbf{类泛素化修饰}，如SUMOylation(小泛素化修饰，SUMO化修饰)和NEDDylation 等。

\redbf{小泛素相关修饰物}(small ubiquitin-relatedmodifier,SUMO)是泛素类蛋白家族的重要成员之一，由98个氨基酸组成，进化上高度保守。

SUMO化修饰也需要E1、E2和E3的参与。\redbf{这种把SUMO转移到底物的赖氨酸残基上，稳定靶蛋白使其免受降解的过程称为SUMO化修饰。}


与泛素化修饰异同：
\begin{itemize}
    \item SUMO与泛素之间具有18\%的同源性，并且两者都具有典型的$\beta \beta \alpha \beta\beta\alpha\beta$折叠，但两者表面电荷分布不同，暗示其功能不同。
    \item 。与泛素类似，SUMO也以前体形式被合成，并且在羧基端水解酶的作用下加工为成熟的SUMO。SUMO化修饰类似于但又不同于泛素化修饰。
    \item 与泛素介导的蛋白质降解不同，SUMO阻碍泛素对底物蛋白的共价修饰，\redbf{提高了底物蛋白的稳定性}。
\end{itemize}

\subsection{蛋白质的NEDDylation}
NEDD8能像泛素一样在体内固有酶簇作用下被共价结合到底物蛋白上，参与蛋白质翻译后修饰，这一过程被称为\redbf{NEDDylation}。

NEDDylation的发生机制与泛素化相似，需要连接酶E1、E2、E3介导的一系列酶促反应。

NEDD8可以通过其C端第76位的甘氨酸与底物的赖氨酸共价结合。

底物的去NEDDylation 是由去NEDDylation酶介导的，NEDD8在去NEDDylation后重新进入循环。

NEDDylation修饰不会引起蛋白质的降解，而主要通过该种修饰来调节蛋白质的功能。
\begin{kaobox}
\vem
\redbf{泛素调控的蛋白质降解具有重要的生理意义}，它不仅能够清除错误蛋白质，对细胞生长周期、DNA复制以及染色体结构都有重要的调控作用，而且对于理解细胞的许多生理过程和新药的开。发也具有重要意义。
\end{kaobox}
\subsection{蛋白质一级结构对稳定性的影响}
\redbf{成熟蛋白质N端的第一个氨基酸(除N端切除的甲。硫氨酸之外，包括翻译后修饰产物)在蛋白质的降解中有着举足轻重的影响。}

当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，平均2~3min就被降解了。