基因功能研究技术

分子生物学

第六章知识点总结

\chapter{基因功能研究技术}
\section{基因表达研究技术}
\subsection{转录组测序分析和RNA-Seq}
\redbf{转录组(transcriptome)}，广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA (RNA)、转运RNA(tRNA)及非编码RNA(non-coding RNA或sRNA)；\redbf{狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。}

\redbf{传统的Sanger测序法}对转录组进行研究的方法主要包括:\bluebf{表达序列标签(expressed sequence tag，EST)测序技术}和\bluebf{基因表达系列分析技术}(serialanalysis of expression,SAGE)。


\redbf{EST测序数据}是目前数量最多，涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短(每个转录本测定400~500bp)，测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。

\redbf{SAGE测序法}用不同转录本3'端第一个CATG位点下游14 bp长的短标签序列来标识相应的转录本。由于标签序列较短，可以将多个标签串联测序，使SAGE法相对于EST测序在\redbf{通量}上大大提高。但过短的序列标签使得\redbf{序列唯一性}降低，即使改进过的Long SAGE用21 bp标签测序，仍然有约一半的标签无法被准确注释到基因组上。

Sanger测序是第一代测序，它是使用的链终止法。
\begin{itemize}
    \item 首先，加热变性使双螺旋解螺旋，然后将引物结合到一条链上
    \item 将结合了引物的序列等量放入4个反应体系中，然后将dna聚合酶和dNTPs加入各个反应体系中；
    \item 在四个不同的反应体系中分别加入A,TC,G四种带荧光标记的3’端被去-OH的ddNTP，将体系混合(用来终止各个反应)
    \item 将反应结束的四个体系进行电泳（这种电泳的精度很高，可以精确到1个bp）；
    \item 然后就可以根据结果来确定dna序列的碱基序列（越轻的dna片段跑得越快，所以从下往上读）
\end{itemize}
\redbf{高通量测序技术}又名深度测序，包括二代测序和三代测序，可以一次性测序几十万甚至几百万条序列，是传统测序技术的一次革命。

\redbf{二代mRNA建库测序的主要流程}:首先提取高质量的组织或细胞总RNA，质量检测合格后用(polyT)磁珠富集mRNA并打断成短片段，用随机引物反转录成cDNA，并进行DNA末端修复、加碱基A、加测序接头，进行PCR扩增后建库，最后选择合适的平台测序。
\begin{figure}[H]
    \centering
    \includegraphics[width=0.96\textwidth]{img/二代转录组建库测序.png} % 替换为你的图片文件名
    \caption{二代转录组建库测序流程图示}
    \label{fig:Second-generation transcriptionome library sequencing}
\end{figure}
获得大量的短DNA序列（大量的Reads）

利用高通量测序技术对转录组进行测序分析，对测序得到的大量原始读长(reads)进行过滤、组装及生物信息学分析的过程被称为\redbf{RNA-Seq}。

以单位长度转录本上覆盖的读长数目(reads per kilo-base gene per million bases，\redbf{RPKM})作为衡量基因表达水平的标准。

由于二代测序的RNA-seq读长较短，其基因转录产物是通过一定的算法进行组装得到的，会导致较多的嵌合体组装错误，对后续转录组分析影响大\redbf{（缺点）}

\redbf{三代测序法}:建库过程中无需打断转录本，其平均10~15 kb的读长可以轻松跨越从5’端到3'-poly(A)尾巴的完整转录本，从而准确鉴定异构体，并对可变剪接、融合基因、同源基因、超家族基因或等位基因表达等进行精确分析。

与二代测序相比，三代测序价格较高并有一定的\redbf{碱基测序错误率}，因此，实践中常将各个组织混合进行三代测序得到准确的\redbf{全长转录物}，然后通过对各个组织或者细胞样本单独进行二代测序，从而准确鉴定基因在各个组织中的表达水平。

\subsection{RNA选择性剪切}
选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的\redbf{重要表现形式。}

分析人类基因组数据发现，有\redbf{60\%的基因}在表达过程中可通过选择性剪接产生各种形式的mRNA。

最新的研究表明，果蝇的Dscam基因最多可能够产生38016种不同形式的剪接体。
\subsection{原位杂交技术}
\redbf{原位杂交}(in situ hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，通常分为\redbf{RNA原位杂交}和\redbf{染色体原位杂交}两大类。

\redbf{RNA原位杂交}用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。

\redbf{荧光原位杂交}(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
\subsection{基因定点突变技术}
\redbf{定点突变}(site-directed mutagenesis)是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。\redbf{基因的定
点突变是我们进一步了解蛋白质的结构与功能关
系的重要手段。}

PCR技术的出现大大促进了定点突变技术的发展，简化了实验操作程序，提高了突变效率。科学家主要采用两种PCR方法，\redbf{重叠延伸技术和大引物诱变法}，在基因序列中进行定点突变。


\section{基因敲除技术}
\subsection{基本原理}

经典遗传学(forward genetics)是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。

现代遗传学(reverse genetics，反向遗传学)首先从基因序列出发，推测其表型，进而推导出该基因的功能。

\redbf{基因敲除}(gene knock-out)又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。

\redbf{完全基因敲除}指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，\redbf{条件型基因敲除}(又称不完全基因敲除)指通过定位重组系统实现基因敲除。

\redbf{正向选择基因}neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。neo基因有双重作用，一方面形成靶位点的插入突变，同时可作为正向筛选标记。

\redbf{负向选择基因HSV-tk}被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。
\subsection{基因编辑技术}
\redbf{基因组编辑}(genome editing)技术是利用序列特异核酸酶在基因组特异位点产生DNA双链断裂，从而激活生物体自身的同源重组或非同源末端连接修复机制，以达到特异性改造基因组之目的。

\redbf{锌指核酸酶}(ZFN)和\redbf{转录激活样效应因子核酸酶}(TALEN)是2013年之前应用最为广泛的基因组编辑工具。

随 着 \redbf{CRISPR/Cas9系统} 的开发及利用，基因组编辑技术的应用出现了新的高潮。
在基因组特异位点产生DNA双链断裂
\subsubsection{CRISPR/Cas9}

CRISPR/Cas9是细菌及古菌适应性免疫系统的一部分，其功能是抵御病毒及外源DNA的入侵。

CRISPR/Cas系统由\redbf{CRISPR序列和Cas基因家族}组成。其中，CRISPR序列由一系列\redbf{间隔序列及高度保守的正向重复序列}相间排列形成，Cas基因簇位于CRISPR序列的5'端，编码的蛋白质可特异性\redbf{切割外源DNA}。

Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域:\redbf{RuvC-like结构域和HNH结构域}，其中，HNH结构域切割原型间隔序列中与crRNA互补配对的DNA链，RuvC-like结构域切割另一条非互补链

CRISPR/Cas系统分为I型、I型和II型，以II型的应用最为广泛。有外源DNA入侵时，CRISPR序列转录并被加工形成约40nt的成熟\redbf{crRNA}(CRISPRRNAs)

成熟的 \redbf{crRNA与tracrRNA}(trans-activatingCRISPR RNA)通过碱基互补配对形成双链RNA，激活并引导Cas9切割外源DNA中的原型间隔序列。

只要改变sgRNA中的20nt引导序列，\redbf{基因组上任意5'-(N)$_{20}$-NGG-3'序列}都可被CRISPR/Cas9系统编辑。

先把该序列克隆到相应的含有\redbf{sgRNA骨架和Cas9基因}的表达载体中，一般由U6或U3启动子驱动sgRNA在细胞中的表达。将构建好的载体导入到植物细胞中，使sgRNA和Cas9在细胞中瞬时或稳定表达。
\section{蛋白质及RNA相互作用技术}
\subsection{酵母单杂交技术}
\redbf{酵母单杂交系统}(yeast one-hybrid system)可在酵母细胞内研究真核生物中\redbf{DNA-蛋白质}之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。此外，该体系也是分析鉴定\redbf{细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法}。

目前，酵母单杂交体系主要用来确定某个\redbf{DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用}，用于分离编码结合于特定顺式作用元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，\redbf{验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核酸序列}。
\subsection{酵母双杂交技术}
\redbf{酵母双杂交系统}(Yeast two-hybrid system)巧妙地利用真核生物转录调控因子的组件式结构(modular)特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录激活结构域(AD)是转录激活因子发挥功能所必需的。
\subsection{蛋白质相互作用技术}
\subsubsection{等离子表面共振技术（SPR）}
\subsubsection{\redbf{免疫共沉淀技术（Co-IP）}}
\redbf{CoIP}的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中。若靶蛋白与待筛选蛋白质有相互作用，那么待筛选蛋白质就通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离出来。
\subsubsection{GST融合蛋白沉降技术}
GST沉降试验通常有两种应用:\redbf{确定探针蛋白与未知蛋白间的相互作用，确证探针蛋白与某个已知蛋白质之间的相互作用}
\subsubsection{细胞内蛋白质相作研究——荧光共振能量转移(FRET)}
\redbf{FRET} (fluorescence resonance energy transfer)荧光能量给体与受体之间通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程称为长距离能量转移。

FRET有3个基本条件:
\begin{itemize}
\item 给体与受体在合适的距离(1~10nm);
\item 给体的\redbf{发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠};
\item 给体与受体的偶极具有一定的空间取向。
\end{itemize}

研究蛋白质间相互作用时，FRET一般与荧光成像技术联用，
将\redbf{蛋白质标记上荧光探针}，当蛋白质间\redbf{不发生相互作用}时，
其\redbf{相对距离较大，无FRET现象}，而蛋白质发生相互作用时，
其\redbf{相对距离缩小，有FRET现象发生}，可根据成像照片的色
彩变化直观地记录该过程
\subsection{染色质免疫共沉淀技术（ChIP）}
\redbf{染色质免疫共沉淀 (ChIP)}技术是一项新发展的研究活体细胞内染色质DNA与蛋白质相互作用的技术。


\section{其他分子生物学技术}
\subsection{凝胶滞缓实验}
凝胶滞缓试验(\redbf{EMSA})是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

其基本原理是，蛋白质与DNA结合后将大大增加\redbf{相对分子质量}，而凝胶电泳中DNA朝正电极移动
的距离与其\redbf{相对分子质量的对数}成正比，因此，
\redbf{没有结合蛋白质的DNA片段迁移得快，而与蛋白
质形成复合物的DNA由于受到阻滞而迁移得慢}。
\subsection{噬菌体展示技术}
噬菌体展示技术的基本原理是将编码“诱饵”蛋
白(你研究中所发现的任何感兴趣的蛋白质)的
DNA片段插入噬菌体基因组，并使之\redbf{与噬菌体外
壳蛋白编码基因相融合}。融合蛋白被作为结构外壳蛋
白呈现到病毒粒子的表面

\subsubsection{筛选方法}
\redbf{直接法亲和筛选}是将靶蛋白质分子耦联到固相支持物
上，文库噬菌体与固相支持物温育后洗去未结合的噬菌
体，即获得与所筛选蛋白有亲和性的噬菌体。

\redbf{间接法亲和筛选}是将\redbf{生物素标记的蛋白质分子}
与\redbf{文库噬菌体温育后铺在含有链亲和素的平皿上，
洗去未结合的噬菌体}，保留在平皿上的就是结合
状态的噬菌体。洗脱结合状态噬菌体后感染细菌，
连续几次亲和纯化反应后就能择性富集并扩增结
合靶蛋白的噬菌体。

\subsection{蛋白质免疫印记实验}
蛋白质免疫印迹(Western blotting，WB)是20世纪70
年代末80年代初在\redbf{蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定}
基础上发展起来的一种技术，是分子生物学中最常
用的蛋白质研究技术，为检测样品中是否存在蛋白
抗原提供了一种可靠的方法。

免疫印迹法的基本原理是\redbf{被测蛋白质只能与标记
的特异性抗体相结合}，而这种结合不改变该蛋白
质在凝胶电泳中的相对分子质量。

\redbf{影响免疫印迹}的一个主要因素是抗原分子中\redbf{可被
抗体识别的表位性质}，第二个影响因素是\redbf{蛋白原液中的抗原浓度}

\subsection{细胞定位及染色技术}
最常用的是\redbf{荧光蛋白标记和免疫荧光法}

\redbf{免疫荧光技术}是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)
与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细
胞内定位的方法。

用针对特异蛋白抗原的\redbf{荧光标记抗体作为分子探
针检测细胞或组织内的相应抗原}，由于所形成的
抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜
观察标本，确定荧光所在细胞或组织，从而对抗
原蛋白进行定位。

\subsection{RNAi技术及其应用}
\redbf{RNAi} (RNA interference，RNA干涉)技术利用双
链小RNA高效、\redbf{特异性降解细胞内同源mRNA}从而
阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。

因此，\redbf{siRNA是导致基因沉默和序列特异性RNA降解的重要中间媒介。}

由siRNA中的反义链指导形成称为RNA诱导的沉默复合体
(RISC)的核蛋白体，再由\redbf{RISC}介导切割目的mRNA分子中与\redbf{siRNA反义链互补的区域}，从而实现干扰靶基因表达的功能。

siRNA还可作为特殊引物在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，后者又可被降解为新的\redbf{siRNA}，重新进入上述循环。