DNA、RNA及蛋白质操作技术

分子生物学

第五章知识点总结

\chapter{DNA、RNA及蛋白质操作技术}


\section{基本介绍}
\redbf{基因操作}主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

\redbf{基因工程}是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。

因为重组DNA的核心是用\redbf{限制性内切核酸酶}(restriction endonuclease,RE)和\redbf{DNA连接酶}(DNA ligase)对DNA分子进行体外切割与连接，所以，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。

此后，\redbf{多种限制性内切酶}被陆续发现，识别的序列多为\redbf{回文序列}且切割后形成\redbf{黏性末端}，少数为\redbf{非回文序列}(如Bsa I)，也有些切割成\redbf{平末端}(如PvuII)

\redbf{具备自主复制能力}的DNA分子就是分子克隆的\redbf{载体}(vector)，病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。

\redbf{pSC101}是第一代质粒载体，是一种\redbf{严紧型}复制控制的低拷贝质粒，因此，从带有该质粒的宿主细胞中很难大量提取质粒DNA，不利于后续实验的进行。

\redbf{CoIEI}质粒载体是一种松弛型复制控制的多拷贝质粒，每个宿主细胞中的拷贝数可达到1000~3000个。

\redbf{pBR322}质粒载体，有较高的拷贝数，便于制备重组DNA。由3部分
组成:
\begin{itemize}
    \item 氨苄抗性基因(amp$^r$)
    \item 四环素抗性基因(tet$^r$)
    \item DNA复制起点(ori)
\end{itemize}
\redbf{pUC}质粒载体包括4部分:
\begin{itemize}
    \item 氨苄抗性基因(amp$^r$)
    \item β-半乳糖酶基因(lacZ)启动子
    \item DNA复制起点(ori)
    \item lacZ'基因
\end{itemize}
获得了用外源DNA片段和载体分子连接后的重组载体后，还必须通过一个\redbf{细菌转化}的过程将其重新导入到宿主细胞中，才能保证重组载体的增殖。

\begin{kaobox}
    那么不同物种的外源DNA片段是否也可在大肠杆菌细胞中增殖呢?
    \begin{itemize}
        \item 类似pSC101的质粒DNA分子可以作为基因克隆的载体，从而将外源DNA导入宿主细胞。\redbf{(可克隆)}
        \item 来自高等生物非洲爪蟾基因片段可以被成功地转移到原核细胞中并实现功能表达。\redbf{(异源表达)}
        \item 质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。\redbf{(基因克隆体系)}
    \end{itemize}
\end{kaobox}
\section{DNA基本操作技术}
\subsection{基因组DNA的提取}
广义的\redbf{基因组（genome）}是指一个单倍体细胞内细胞核、线粒体和叶绿体中所包含的全部DNA。

我们通常说的基因组DNA则特指细胞核内染色体上的包括\redbf{编码区和非编码区}在内的全部DNA分子。
\subsubsection{DNA的提取}
对于植物组织，通常先用液氮速冻帮助研磨来破碎细胞壁，随后加入裂解液破碎细胞，释放细胞核及核内的染色质。植物组织一般加入\redbf{一种阳离子去污剂——CTAB}，它可以更好地除去细胞壁中的多糖成分，溶解细胞膜，并与释放出来的核酸形成复合物。

动物组织及细胞材料一般加入SDS进行裂解。SDS是一种\redbf{阴离子去污剂}，可溶解细胞膜，并使蛋白质变性，释放出染色质中的DNA。

DNA的浓度和纯度可通过测定其OD$_{260}$和OD$_{280}$
来判断。
\begin{itemize}
    \item O$_{260}$为1时相当于浓度为50ug/mL；
    \item O$_{260}$/OD$_{280}$的比值如果在\redbf{1.8~2.0}之间，表示所提取的DNA纯度较好；
    \item O$_{260}$/OD$_{280}$的比值明显低于1.8，表示样品中有蛋白质或酚污染。
\end{itemize}
\subsection{核酸凝胶电泳}
核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，在电场中向\redbf{正电极}方向迁移。由于核酸分子中的磷酸基团的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度(电泳迁移率)，\redbf{取决于核酸分子本身的大小}。因此，可通过电泳将不同长度的核酸分子彼此分\redbf{(DNA的迁移率)}离开来。

\subsubsection{DNA电泳分离}
将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的的电泳介质。凝胶的分辨能力与\redbf{凝胶的浓度}有关，分辨DNA片段的范围为0.2~50kb。\redbf{(分辨率)}

要分辨较小的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1~1000bp。\redbf{凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。}

\bluebf{浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA}

\bluebf{浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA}


\redbf{脉冲电场凝胶电泳(PFGE)技术}:普通琼脂糖凝胶电泳很难分离大于50kb的DNA分子，为了进行超大片段DNA研究，科学家发明PFGE技术，用于分离超大相对分子质量(有时甚至是整条染色体)DNA。

\subsubsection{检测}
因为\redbf{溴化乙锭}(ethidium bromide，EB)能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在紫外光照射下发出荧光，所以，常在琼脂糖凝胶冷却凝固前，加入适量溴化乙锭，电泳完毕后将凝胶放置在300nm波长的紫外光下，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中的DNA(约50ng)条带。

\subsection{聚合酶链式反应(PCR)技术【重要】}
目前体外快速扩增特定基因片段最常用的方法。

首先将模板DNA(质粒、基因组DNA或mRNA反转录产生的cDNA)在临近沸点的温度下\redbf{变性}成单链，然后DNA聚合酶在\redbf{一对引物(小段单链DNA)}的引导下以单链DNA为模板并利用反应混合物中的\redbf{4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)}合成新的DNA互补链。

\subsubsection{具体过程}

整个PCR反应的过程包括:\redbf{DNA解链(高温变性)}、\redbf{引物与模板DNA相结合(降温退火)}、\redbf{DNA聚合酶催化新链DNA合成(链的延伸)}3步，经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2$^n$。

\subsection{重组载体的构建}
\begin{enumerate}
    \item 引物设计
    \begin{itemize}
        \item GC含量控制在40\%~60\%，
        \item Tm值在60°C左右
        \item 两个DNA引物的5'端还需要各加上一个\redbf{限制性内切核酸酶}的识别位点及其保护碱基，而所选择的外切核酸酶必须与载体上的多克隆位点相匹配。
    \end{itemize}
    \item 引物合成后，用\redbf{PCR扩增目的基因片段}。
    \begin{itemize}
        \item 通过\redbf{琼脂糖凝胶电泳}检测目标条带是否符合预期
        \item 如果条带单一，只需要将\redbf{PCR产物}通过硅胶膜纯化柱进行纯化就可以了；
        \item 条带不单一，还需要在电泳后，在紫外灯下对目标条带进行\redbf{割胶回收}，溶胶后同样用\redbf{硅胶膜纯化柱}纯化。
    \end{itemize}
    \item 用相同的内切核酸酶在适当温度下分别\redbf{双酶切目的基因片段和载体DNA}。
    \item 根据所加DNA总量，确定酶切10 min至数小时，保证酶切完全。用\redbf{T4 DNA连接酶}进行连接反应。
    \item 重组载体转化细胞
    \begin{itemize}
        \item 将连接产物与感受态细胞在试管中混匀，于冰上静置30min，然后转移到\redbf{42°C热刺激30~90s}，此时连接产物就可能被感受态细胞吸收。再将其置于37°C摇床复苏约1h，然后均匀地涂布在含有抗生素的培养基上，37°C倒置培养。
        \item 抗性筛选:因为连接产物，即重组后的质粒载体上带有\redbf{抗性基因}和表达元件，从而使重组大肠杆菌细胞能够在培养基中存活下来。
    \end{itemize}
\end{enumerate}
\subsubsection{恒温一步法}
恒温一步法(不依赖T4 DNA连接酶的克隆技术)

首先将载体线性化，通过引物设计在插入片段两端引入线性化载体的末端序列(15~25bp)，PCR扩增插入片段后，\redbf{其两端具有与线性化载体末端相同的序列}。然后按一定比例加入插入片段和线性化载体，再加入dNTP，在T5\redbf{外切核酸酶}、\redbf{DNA聚合酶和TaqDNA连接酶}的混合催化下，50°C恒温反应15~30min即可完成连接反应。

由于连接成功的重组载体数量有限，远远不能满足实验需求，有必要通过\redbf{细菌转化}以获得大量重组载体的拷贝。

大肠杆菌在CaCl$_2$溶液处理后，细胞膨胀，细胞膜通透性发生改变，易于吸附外源DNA，这种状态的细胞被称作\redbf{感受态细胞}。
\subsubsection{阳性菌落鉴定}
过夜培养后培养基上应该长出很多单菌落，随机挑取部分菌落，用菌内的重组质粒做DNA模板，进行\redbf{菌落PCR(colonyPCR)扩增}，鉴定目的基因片段是否插入载体中。

挑取阳性菌落液体培养基中37°C培养10~13h，而后采用碱裂解法提取细菌中的质粒DNA。

在强碱性溶液中裂解菌体，释放质粒DNA，然后用酸中和反应，离心收集上清液后，通过\redbf{硅胶膜纯化柱}纯化出质粒DNA，经酶切鉴定和测序确定序列无误后用于进一步的实验。

\subsection{实时定量PCR}
\redbf{实时定量PCR(real time quantitative PCR)}:利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，从而消除在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。

\subsection{基因组DNA文库的构建}
把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列(理论上每个DNA序列至少有一份代表)克隆的总汇被称为\redbf{基因组DNA文库}。

构建基因组DNA文库的\redbf{第一步}是制备大小合适的随机DNA片段，\redbf{在体外将DNA片段}与适当的载体相连成重组子，转化到大肠杆菌或其他受体细胞中，从转化子克隆群中筛选出含有靶基因的克隆。

为保证能从基因组文库中筛选到某个特定基因，基因组文库必须具有一定的代表性和随机性。\redbf{也就是说文库中全部克隆所携带的DNA片段必须覆盖整个基因组。(覆盖度)}

构建基因组文库最常用的是$\lambda$噬菌体载体(克隆能力15~20kb)

细菌，真菌等
$\lambda$噬菌体文库构建方法简单高效，所获得的文库易于用分子杂交法进行筛选。
常用识别4个核苷酸的限制性内切核酸酶Sau3A部分消化基因组DNA，因为Sau3A与BamHI是一对同尾酶，所以由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的入噬菌体载体上\redbf{(基本流程)}。

构建基因组文库最常用的是\redbf{$\lambda$噬菌体载体}(克隆能力15~20 kb)和限制性内切酶部分消化法。

高容量克隆载体，如\redbf{柯斯质粒、细菌人工染色体(BAC)、P1源人工染色体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)}都可用于基因组文库的构建。


它们的优点是可以插入大片段DNA，如柯斯质粒可以接受大至45kb的插入，但是\redbf{稳定性相对较差，在大量的复制过程中容易出现缺失现象。}BAC、YAC、PAC可以容纳70~1000kb的外源片段，主要用于基因组作图，测序和克隆序列的比对。
\section{RNA基本操作技术}
\begin{kaobox}
RNA研究的重要性：

真核生物基因组DNA非常庞大，而且含有大量重复序列，无论用电泳分离技术还是用杂交方法都难以直接分离到靶基因片段。而cDNA(complementaryDNA)是来自反转录的mRNA，不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快地分离到相关基因。
\end{kaobox}

\subsection{总RNA的提取}
细胞中的总RNA包括\redbf{编码蛋白质的mRNA和不编码蛋白质的ncRNA(RNA、tRNA以及其他RNA)}。

一个细胞中80\%~85\%为rRNA，15\%~20\%为RNA及其他ncRNA，mRNA占总RNA的1\%~5\%，细胞中\redbf{mRNA占比低}，而且呈单链状易受核酸酶的攻击，因而对RNA的操作要保证实验环境、所用器皿及溶液均没有RNA酶。\redbf{(RNA的稳定性)}

总RNA的提取方法：\redbf{异硫氰酸胍-苯酚抽提法}。

\subsection{mRNA的纯化}
经过两次寡聚(dT)纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。

实验中常用poly(AT)Tract mRNA分离系统将\redbf{生物素}标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA温育，加入与微磁球相连的\redbf{抗生物素蛋白}以结合poly(A)mRNA，通过磁场吸附作用将poly(A)mRNA从总RNA中分离。
\subsection{cDNA的合成}
cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。

\redbf{第一链cDNA}的合成是以 mRNA为模板，反转录时加入\redbf{oligo(dT)}做引物，在反转录酶催化下形成cDNA。Oligo (dT)引物一般包含12~20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个连接引物(通常为XhoI等酶切位点)以便于克隆构建。

在cDNA合成过程中，应选用活性较高的反转录酶及\redbf{甲基化dCTP}，同时cDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链cDNA的方向性。
\subsection{cDNA文库的构建}
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，将包含细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织的\redbf{cDNA文库}。

用途:\redbf{筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。}
\subsection{cDNA文库的筛选}
\redbf{基因文库的筛选}:指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。

基因文库的筛选方法包括:\redbf{核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法等。}
\begin{itemize}
    \item 核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的方法之一，常用放射性标记的特异DNA探针进行高密度的菌落杂交筛选。
    \item PCR筛选法是以特异引物为基础，通过PCR扩增来鉴定含有目的基因片段的克隆，适用于基因文库中目的基因片段较短的情况。目的基因探针对每个孔进行PCR筛选
    \item 免疫筛选法：基于抗原抗体特异性结合原理，适用于对表达文库的筛选。
\end{itemize}
\subsection{非编码RNA的研究技术}
高等真核生物的基因组中，蛋白质编码区只占很少一部分，非蛋白质编码区占据基因组中绝大部分位置。而高等真核生物基因组中一半以上的DNA会转录为RNA，所以大部分RNA是不编码蛋白质的，这些RNA被统称为\redbf{非编码RNA (non-codingRNA，ncRNA)}。

非编码RNA的种类很多，但是根据功能不同：
\begin{itemize}
    \item \redbf{组成型的非编码RNA}，如rRNA和tRNA，它们是蛋
白质合成机器的重要组成成员
    \item \redbf{调控型的非编码RNA}，包括miRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、IncRNA及circRNA等，它们在转录和翻译水平调控基因表达，维持基因组的稳定，或在细胞功能与命运的决定中发挥至关重要的作用。
\end{itemize}

\redbf{非编码RNA无poly(A)尾巴的结构}，无法通过寡聚(dT)直接分离，而其他的分离方式又会受到含量较大的rRNA及部分RNA的干扰，所以目前只能依据非编码RNA的大小和形态结构，通过以下三种方式分离出不同的非编码RNA。
\begin{itemize}
    \item 对于小RNA：如miRNA、siRNA等常常小于50 nt分离：聚丙烯酰胺电泳分离出小于50 nt的RNA（割胶回收）。
    \item 从总RNA样品中去除rRNA和tRNA，再分离其他非编码RNA。先合成rRNA和tRNA特异性生物素标记的寡核苷酸探针，
    \item 闭合环状结构的RNA (cirRNA)的分离：\redbf{将rRNA和tRNA从总RNA中除去后，使用具有3′端核糖核酸外切酶活性的RNaseR专一性降解单链线性RNA分子}
\end{itemize}
\section{基因克隆技术}
在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和
复制这种过程称为\redbf{克隆}。
\subsection{RACE技术}
\redbf{cDNA末端快速扩增法}(rapid amplification of cDNAends，RACE)是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5′端或3′端缺失序列的技术，在很大程度上依赖于RNA连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增。
\section{蛋白质与蛋白质组学技术} 
\subsection{双向电泳技术}  
\redbf{双向电泳}(two-dimensional electrophoresis，2-DE)技术是分离大量混合蛋白质组分的最有效方法，该技术主要依赖于蛋白质等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)双向电泳技术，通过等电点和相对分子质量分离不同的蛋白质。

在电场作用下，在以两性电解质为介质的电泳体系中，\redbf{不同等电点}的蛋白质会聚集在介质上不同的区域(等电点)从而被分离。
\subsection{荧光差异显示双向电泳技术}
\redbf{荧光差异显示双向电泳技术}(2-D fluorescencedifference gel electrophoresis，2D-DIGE)在2-DE上结合多重荧光分析技术，克服2-DE的系统误差问题，提高了实验结果的可重复性和可信度。
\subsection{蛋白质质谱分析技术}
现行的质谱仪可分为3个连续的组成部分，即离子源、离子分离区和检测器。目前常用的是基质辅助的\redbf{激光解析电离-飞行时间质谱 (MALDI-TOF)和电喷雾质谱 (ESI-MS)}。

\redbf{MALDI-TOF的工作原理}是将从2-D胶中分离得到的或其他来源的蛋白质酶解成小肽段后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去。离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷，\redbf{这些气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m/z)决定。}

一级质谱将经蛋白酶降解后的肽段按照质荷比(m/z)及强度(intensity)进行解析，\redbf{形成肽指纹图谱(PMF)}，每个母离子峰代表一种肽段，其强度代表了肽段多少。